奥硝唑氯化钠注射液无菌检查方法的建立

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奥硝唑在体内主要以具有细胞毒作用的原药和具有细胞毒作用的中间代谢活性产物,作用于厌氧菌、阿米巴虫、贾滴虫和毛滴虫细胞的DNA,使其螺旋结构段裂或阻断其转录复制而至其死亡,达到抗菌抗原生质的目的。目的 建立适宜的奥硝唑氯化钠注射液无菌检查方法,对所建立方法进行方法学验证,确认所建立的检查方法适合本品无菌检查,使药品质量得到有效控制。方法 采用薄膜过滤,探索该制剂的无菌检查方法。结果 所建立的无菌检查方法适用于奥硝唑氯化钠注射液的无菌检查。

关键词:方法学验证 奥硝唑氯化钠注射液 薄膜过滤法

奥硝唑在体内主要以具有细胞毒作用的原药和具有细胞毒作用的中间代谢活性产物,作用于厌氧菌、阿米巴虫、贾滴虫和毛滴虫细胞的DNA,使其螺旋结构段裂或阻断其转录复制而至其死亡,达到抗菌抗原生质的目的。依据《中国药典》无菌检查相关规定及参阅相关文献[1-6],本文采用薄膜过滤法对奥硝唑氯化钠注射液进行无菌方法验证,确定本品检验方法及检验条件。

1.材料与仪器

1.1 试药

奥硝唑氯化钠注射液,规格:100ml:奥硝唑0.25g与氯化钠0.9g,四川科伦药业股份有限公司

1.2 仪器

HTY-2000B 型智能集菌仪 杭州泰林生物技术有限公司,SW-CJ 超净工作台 苏州净化设备有限公司,BSC-1000B型生物安全柜 北京东林哈尔仪器有限公司,LRH型生物培养箱 上海一恒科技有限公司。

1.3 验证用菌株

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉菌,以上菌种由中检所提供。

1.4 培养基

营养肉汤培养基(批号:140110)、营养琼脂培养基(批号:140303)、玫瑰红钠琼脂培养基(批号:140706)、硫乙醇酸盐流体培养基(批号:140711)、改良马丁培养基(批号:140641)。

2.方法与结果

2.1 实验环境

在B级下局部A级的单向流区域内进行,实验过程中严格按照无菌操作,防止微生物污染。

2.2 接种及菌液制备

取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌斜面培养物至营养肉汤中,于30℃培养。取白色念珠菌斜面培养物至改良马丁培养基中,于25℃培养。另取生孢梭菌液体培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中,于35℃培养。

取经35℃培养的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌营养肉汤培养物各1ml及生孢梭菌硫乙醇培养物1ml分别加入到9ml的营养肉汤中,依次稀释,枯草芽孢杆菌至10-5,金黄色葡萄球菌至10-6,铜绿假单胞菌至10-7,生孢梭菌至10-6。 取经25.8℃培养24小时的白色念珠菌改良马丁培养物1ml,加至营养肉汤中,依次稀释至10-6。取经培养5天的黑曲霉斜面培养物,加3ml营养肉汤洗下孢子依次稀释至10-4,备用。上述各菌株的培养物均为第二代培养物。

2.3 方法验证

按照《中国药典》2010版药典无菌检查项下方法,每种培养基过滤样品10瓶。用0.1%蛋白胨水溶液冲洗,每筒总冲洗量为500ml,每次100ml。分别加入已制备好的上述各菌液1ml,过滤,向金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌筒内分别加入硫乙醇酸盐流体培养基。32~35℃培养5天,逐日观察,向白色念珠菌、黑曲霉筒内分别加入改良马丁培养基,25~28℃培养5天,逐日观察。另取6个筒,4筒分别加入上述已制备好的金萄菌、铜绿假单胞菌、枯草杆菌、生孢梭菌菌液,分别加入硫乙醇酸盐流体培养基。32~35℃培养5天,逐日观察,向另2个筒分别加入白色念珠菌及黑曲霉菌液各1ml,分别加入100ml改良马丁培养基,25~28℃培养5天,逐日观察。

供试品对照组:取供试品,共制备2组。用适量冲洗液润湿滤膜,将供试品过滤。用0.1%蛋白胨水溶液冲洗,每筒总冲洗量为500ml,每次100ml。每次冲洗到一半时,晃动杯壁,冲洗完毕,向2个筒分别加入硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基各100ml,25~28℃培养5天,逐日观察。阴性对照:取0.1%蛋白胨水溶液适量,置入两个滤筒中过滤,分别加入硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基各100ml,25~28℃培养5天,逐日观察。空白对照:取2个筒,将硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基分别加入到筒中,25~28℃培养5天,逐日观察。取制备好的金葡色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌菌液各1ml于滤筒中,加适量冲洗液冲洗,取出滤膜,菌面朝上,贴于营养琼脂培养基平皿上,30~35℃培养48h。黑曲霉菌菌液1ml于平皿中。倾注玫瑰红钠琼脂培养基10ml,于25~28℃培养72h。

2.4 结果

活菌计数见表1(说明:如不附表,可将该句话和表删掉),与对照组比较,含供试品的各滤筒中试验菌均生长良好,并与各对照组中相应菌生长情况相似。供试品对照组、阴性对照组和空白对照组均无菌落生长。供试品采用滤膜过滤法检查,在此检验量和冲洗量的检验条件下无抑菌作用。因此,可照此检查法和检查条件检查奥硝唑氯化钠注射液的无菌检验。

3.讨论

薄膜过滤法为《中国药典》收载的无菌检查方法中的检验方法之一,采用封闭的薄膜过滤器,把细菌等微生物截留在滤膜上,经过对培养基的培养,使微生物能被检出,检查过程中需严格遵守无菌检查操作规程。在实验过程中注意使供试品溶液覆盖滤膜整个表面,根据试验结果确定奥硝唑氯化钠注射液无菌检查方法,采用薄膜过滤法检查,每种培养基过滤样品10瓶,全量过滤,经过验证,各实验菌生长良好。可按照此检查方法对奥硝唑氯化钠注射液进行无菌检查。

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